【科研摘要】
许多RNA结合蛋白会经历液相-液相分离，这是无膜细胞器形成的基础，例如应激颗粒和P体。细胞相大小的液滴与玻璃表面相互作用的聚结和沉淀阻碍了体外相分离分子机制的研究。最近，瑞士苏黎世联邦理工学院LeonidasEmmanouilidis，GunnarJeschke和FrédéricH.-教授团队证明了证明肉瘤中融合的液滴（一种肌萎缩性侧索硬化症和额颞痴呆患者的胞质聚集体中发现的蛋白质）可以使充当细胞骨架模拟物的琼脂糖水凝胶在体外稳定。
这使得它们可以通过液相NMR和电子顺磁共振波谱进行光谱表征。可以同时观察到来自分散相和浓缩相的蛋白质信号，并且可以精确定量它们各自的比例。此外，琼脂糖水凝胶在震动冻结期间充当防冻剂，这有助于在低温下进行脉冲电子顺磁共振测量。出乎意料的是，双电子-电子共振测量显示凝结相中的FUS压缩。相关论文以题为NMRandEPRrevealacompactionoftheRNA-bindingproteinFUSupondropletformation发表在《NatureChemicalBiology》上。
【图文解析】
US小滴覆盖NMR管
作者研究了人类FUS蛋白的上半部分（1-267），其中包括富含QGSY的片段和第一个精氨酸-甘氨酸重复序列（RGG1）。该蛋白质构建体（N末端结构域，NTD）在使用6M尿素进行纯化的整个过程中保持可溶。稀释变性剂后，FUSNTD形成液滴，如通过光学显微镜观察到的，1H-15NHSQC光谱导致出现其他峰，在尿素存在下不存在（图1a）。Murthy等人最近还使用FUS17的QGSY片段观察到了另一组峰。令人惊讶的是，这组新峰似乎对应于在6M尿素中收集的NMR光谱中看到的峰，在1H和15N方向上系统性的高场位移分别为0.15ppm和0.4ppm（图1b）。使用核磁共振扩散有序光谱学（DOSY），作者评估了源自两组峰的分子的平移扩散。在DOSY实验中，由于蛋白质在漫长的扩散期间（0.08μs）内迅速扩散，因此在强磁场梯度作用下的DOSY实验中，对应于蛋白质可溶形式（分散相）的峰消失了（图1c）。
图1：FUSNTD液滴与玻璃表面的非特异性相互作用。
量化分散相和冷凝相
这两组峰的存在报告了处于两个不同阶段的两个蛋白质分子种群。低百分比的琼脂糖水凝胶是细胞骨架的一个潜在的好模拟物。琼脂糖水凝胶先前已在溶液NMR中使用，并且除了使NMR保持沉默外，还已知它们不会影响无序或球状蛋白质的构象。作者确实可以使用0.5％的琼脂糖水凝胶实现FUS液滴的稳定化，该凝胶是使用以下步骤在NMR管中形成的。在55°C下，将6US尿素中的FUSNTD储备液稀释到含有0.5％琼脂糖的缓冲液中，然后转移到NMR管中，同时样品仍为液态。随着温度逐渐平衡至室温，形成了凝胶，样品变得混浊。在制备后3h，通过目视检查仍可看到这种琼脂糖水凝胶中的高浊度，但是在没有琼脂糖的情况下，由于液滴的沉淀，样品变得清晰（图2a）。这些浊度变化通过使用琼脂糖作为参照的缓冲液的浊度测量来量化（图2b）。当在0.5％琼脂糖和3M尿素（最终浓度）的存在下重复相同的过程时，尽管凝胶仍在形成，但样品仍保持透明（图2a）。
图2：0.5％琼脂糖水凝胶中的FUSNTD液滴。
连续波EPR光谱对相分离很敏感
接下来，作者研究了琼脂糖水凝胶中的液滴稳定是否与连续波（）和脉冲EPR方法的表征兼容。EPR测量需要顺磁中心，这是通过将甲硫代磺酸盐自旋标记（MTSL）定位于FUSNTD位置10上的工程化半胱氨酸而引入的。在光谱法检测到吸收光谱的一阶导数。线形取决于自旋标记的旋转迁移率，是标记残基附近局部拥挤的一个很好的报告者。对于快速旋转的氮氧化物，观察到三个宽度和强度均等的细线。随着旋转迁移率的降低，线变宽变得明显，这对于高场线最为明显。分散状态下自旋标记的A10C（A10CR1）的EPR线宽相当窄（图3a）。这可以通过NTD紊乱并显示出实质性的主链动力学来解释。当使用0.5％琼脂糖水凝胶重复相同的测量时，在分散状态和浓缩状态下的线形以及旋转迁移率都不会受到影响（图3a），再次证实了琼脂糖与FUSNTD的相互作用不会明显改变蛋白质动力学。有趣的是两相样品的光谱揭示了分散样品中不存在的另一种更宽的组分（图3b）。
图3：在单旋标记的A10C上进行EPR测量。
液滴形成时的构象变化
作者可以通过使用双半胱氨酸突变体A10CS29CR1和A105CG128CR1来评估蛋白质内的距离分布。为避免蛋白质间距离的影响，通过将自旋标记的蛋白质与未标记的野生型（WT）蛋白质混合来进行自旋稀释。使用非参数拟合或单个高斯拟合主要的DEER数据会导致形状非常相似的距离分布，因此在分析中采用了高斯分布模型。第一步，作者以1:10的自旋稀释度并使用D2O延长相记忆时间，以50µM的蛋白质浓度测量了单相分散状态下的距离分布。A10CS29CR1（图4a）的距离分布比A105CG128CR1（图4b）的距离分布更窄，平均距离更短，这可以通过半胱氨酸之间较小的序列间隔来合理化。分布的大宽度与该蛋白质区域的无序性质一致。
图4：在A10CS29CR1和A105CG128CR1上进行的DEER测量。
参考文献：/10.1038/s42-3
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